La secuencia completa de bases nitrogenadas que se quiere detectar es: Sonda Muestra problema Secuencia diana Cebador.
La desnaturalización del material genético se consigue: Bajando la Tª o subiendo el pH (alcalino) Subiendo la Tª o bajando el pH (ácido) Subiendo la Tª o el pH (alcalino) Bajando la Tº o el pH (ácido).
En la curva de fusión del ADN, podemos saber el % de desnaturalización midiendo: A260 A280 A230 A320.
La expresión Tm hace referencia a: la temperatura media la temperatura de fusión la temperatura a la cual ha desnaturalizado el 50%.
La Tm indica la temperatura a la cual: ha desnaturalizado el 100% ha desnaturalizado el 50% ha desnaturalizado el 25%.
A mayor concentración de ácidos nucleicos mayor velocidad de desnaturalización mayor velocidad de renaturalización menor velocidad de desnaturalización menor velocidad de renaturalización.
La Tm es directamente proporcional a la: proporción de bases GC concentración.
La velocidad de renaturalización depende de: la fase de nucleación la fase de cierre en cremallera ambas ninguna de las anteriores.
La fase lenta en la que secuencias cortas de bases complementarias se aparean es la fase de nucleación la fase de cierre en cremallera la fase de meseta la fase de crecimiento exponencial.
Los organismos eucariotas se caracterizan por: tener secuencias altamente repetidas no tener secuencias altamente repetidas.
La curva de renaturalización sigmoide es propia de: organismos procariotas organismos eucariotas ambos.
A mayor complejidad de genoma: mayor velocidad de renaturalización menor velocidad de renaturalización.
En organismos eucariotas, las secuencias altamente repetidas renaturalizan rápidamente lentamente muy lentamente.
Si aumenta la concentración de cationes monovalentes, la Tm aumenta disminuye.
Desestabilizan los puentes de hidrógeno la fuerza iónica de la solución DMSO y formamida cationes monovalentes aniones monovalentes.
Los agentes desnaturalizantes aumentan la Tm disminuyen la Tm no influyen en la Tm.
Se denomina mismatch al porcentaje de bases (elige la más correcta) que son complementarias que no son complementarias que no son complementarias y no se unen en el híbrido.
El mismatch aumenta si la sonda es pequeña es grande es independiente del tamaño.
El tamaño medio de una sonda para considerarla una sonda específica es 16 bases 160 bases 600 bases.
La probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda - secuencia diana se denomina especificidad sensibilidad ambas.
Mediante técnicas de ADN recombinante pueden obtenerse sondas de ADN ARN ADN y ARN.
Las ribosondas son sondas de ADN ARN ADN o ARN.
Las sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos se usan en hibridación en soporte sólido en soporte líquido in situ.
Las sondas con esqueleto azúcar fosfato sustituido por un esqueleto poli-aminoetil-glicina son sondas de ADN recombinante sondas LNA sondas PNA sondas de PCR.
Las sondas sin carga eléctrica son las sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) sondas de ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
La detección indirecta de los híbridos ocurre en el marcaje con isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
Detectamos el híbrido con autorradiografía cuando la sonda está marcada con: isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
La técnica que usa para el marcaje de sonda: ADNasa + ADN Pol I + nucleótidos (uno marcado) es el desplazamiento de mella el cebado al azar o aleatorio el marcaje por PCR el marcaje terminal.
La técnica de marcaje de sonda que necesita el fragmento klenow de la ADN Pol I es el cebado al azar o aleatorio el marcaje terminal el marcaje único en el extremo 3' el desplazamiento de mella.
Consiste en la eliminación de los nucleótidos libres, para quedarse únicamente con la sonda, con el fin de evitar interferencias en los resultados purificación de sodas marcaje de sondas limpieza de sondas.
Según las fases de hibridación Fase de hibridación Lavado posthibridación Fase de detección del híbrido Fase de prehibridación.
Para detectar el híbrido, según el tipo de marcador que se haya empleado, se necesita: Isotopos radiactivos (marcaje radiactivo) Fluorocromos Haptenos.
Consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, por complementariedad de secuencias de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria.
La secuencia diana o sonda se inmovilizan en las hibridaciones en soporte sólido en soporte líquido in situ.
Para identificar secuencias diana con sondas en el ADN realizamos northern blot southern blot ambos.
La hibridación se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones de tejido en la hibridación en soporte sólido en soporte líquido in situ.
Técnicas de hibridación En soporte sólido En soporte líquido In situ.
No es necesario desnaturalizar las muestras antes de la transferencia en northern blot southern blot ambos.
La técnica de hibridación en medio sólido donde se inmoviliza la sonda es Dot blot Southern blot Northern blot Microarrays.
La electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes en Southern blot Northern blot ambos.
Podemos rehibridar las membranas con otras sondas cuando uso sondas marcadas con isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
El revelado se realiza mediante un escáner láser en el dot blot southern blot northern blot microarrays.
La técnica de hibridación en medio sólido que no requiere digestión enzimática es el southern blot el northern blot ninguna.
En la técnica de microarrays o biochip se marca la sonda la muestra ambos ninguno.
La muestras se anclan a la membrana de nitrocelulosa o nailon mediante calor irradiación con luz UV ambas.
En el dot blot el revelado se realiza por detección cromogénica (basado en una reacción inmunohistoquímica) si se usan isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
Para realizar la transferencia de ácidos nucleicos se requiere desnaturalización alcalina previa en northern blot southern blot ambas.
En la hibridación con microchips (microarrays - biochips) se marcan las sondas con haptenos las sondas con fluorocromos las muestras con fluorocromos.
La prehibridación se realiza para bloquear uniones inespecíficas de la sonda evitar la formación de híbridos imperfectos impedir formación de mismatch.
La digoxigenina y la biotina son isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
Requiere determinadas condiciones de rigurosidad prehibridación hibridación lavado posthibridación detección del híbrido.
Sus aplicaciones son el estudio de la expresión génica y la hibridación genómica comparada Dot blot Northern blot Southern blot Microarrays.
El híbrido sonda - secuencia diana se forma en placa de microtitulación en la hibridación en medio sólido en medio líquido in situ.
En la técnica FISH se usan sondas marcadas con isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
La técnica CISH utiliza como muestra cromosomas en metafase núcleos en interfase tejidos FFPE.
Técnicas de hibridación in situ FISH CISH.
Visualizamos los híbridos formados mediante CISH con microscopio fluorescente autorradiografía microscopio óptico.
Es necesario realizar una digestión enzimática en la técnica de CISH FISH ambas.
Se realiza una contratinción en la técnica de FISH CISH ambas.
Conseguimos obtener cromosomas en metafase gracias a la colchicina solución de Carnoy proteinasa K pepsina.
La hibridación se realiza en condiciones de desnaturalización en FISH CISH ambas.
En la CISH se usan sondas marcadas con isótopos radiactivos fluorocromos haptenos.
Aplicaciones del dot blot Estudios de expresión génica Determinaciones de sexo Elaboración de huellas genéticas Estudio de mutaciones estructurales Splicing alternativos Control de calidad de PCR y del marcaje de sondas Detección de secuencias extrañas Estudios de corte y empalme Detección de secuencias adquiridas Detección de mutaciones.
Aplicaciones del southern blot Estudios de expresión génica Determinaciones de sexo Elaboración de huellas genéticas Estudio de mutaciones estructurales Splicing alternativos Control de calidad de PCR y del marcaje de sondas Detección de secuencias extrañas Estudios de corte y empalme Detección de secuencias adquiridas Detección de mutaciones.
Aplicaciones del northern blot Estudios de expresión génica Determinaciones de sexo Elaboración de huellas genéticas Estudio de mutaciones estructurales Splicing alternativos Control de calidad de PCR y del marcaje de sondas Detección de secuencias extrañas Estudios de corte y empalme Detección de secuencias adquiridas Detección de mutaciones.
No se marcan ni la sonda ni la muestra en soporte sólido soporte líquido in situ.
Prepara 45 mL de un gel de agarosa al 1% el gel consta de 0'45 g de agarosa, 0'9 mL de tampón y 44'1 mL de agua el gel consta de 0'55 g de agarosa, 0'9 mL de tampón y 44'1 mL de agua el gel consta de 0'45 g de agarosa, 1 mL de tampón y 44'1 mL de agua.
Prepara un tampón de carga que debe contener 0'30% de teñidor (azul de bromofenol), 0'25% de xileno y 0'35% de glicerol. El teñidor se considera másico (%m/v), el xileno se considera másico (%m/v) y el glicerol volumétrico (%v/v), por lo que se necesitan 0'30 g de teñidor por cada 100 mL de agua destilada, 0'25 g de xileno por cada 100 mL de agua destilada, 35 mL de glicerol por cada 100 mL de agua destilada y por diferencia, 65 mL de agua destilada. El teñidor se considera volumétrico (%v/v), el xileno se considera másico (%m/v) y el glicerol volumétrico (%v/v), por lo que se necesitan 0'30 mL de teñidor por cada 100 mL de agua destilada, 0'25 g de xileno por cada 100 mL de agua destilada, 35 mL de glicerol por cada 100 mL de agua destilada y por diferencia, 64'7 mL de agua destilada. El teñidor se considera másico (%m/v), el xileno se considera másico (%m/v) y el glicerol volumétrico (%v/v), por lo que se necesitan 0'30 mL de teñidor por cada 100 mL de agua destilada, 0'25 g de xileno por cada 100 mL de agua destilada, 35 mL de glicerol por cada 100 mL de agua destilada y por diferencia, 64'45 mL de agua destilada. .
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