BM T6 - PCR y Electroforesis

¿Qué significan las siglas PCR?. Reacción en cadena de la polimerasa. Reacción catenaria de polímeros. Radiación de los cationes de la polimerasa. Reacción de cationes de la polimerasa.

La PCR es: una reacción enzimática in vitro de segmentos específicos de ADN que consiste en un proceso de desnaturalización, unión de cebadores específicos y síntesis de ADN. una reacción enzimática in vitro de varios segmentos de ADN que consiste en un proceso de naturalización, unión de cebadores específicos y síntesis de ADN. una reacción enzimática in vitro de varios segmentos de ADN que consiste en un proceso de desnaturalización, unión de cebadores específicos y síntesis de ADN. una reacción enzimática in vitro de segmentos específicos de ADN que consiste en un proceso de naturalización, unión de cebadores específicos y síntesis de ADN.

La PCR aprovecha: la replicación del ADN. la concentración del ADN. la integridad del ADN. la conservación del ADN.

Es cierto en cuanto a la PCR. Amplifica in vitro un fragmento de ADN. Técnica muy específica, rápida y sensible para detectar cantidades ínfimas de ADN y permitir su identificación. Aprovecha la replicación del ADN. Es una reacción enzimática in vitro de segmentos específicos de ADN. Aprovecha la integridad del ADN. La amplificación del ADN es lineal en magnitud.

Componentes para hacer una PCR. ADN molde. ADN polimerasa termoestable. Cebadores, primers, iniciadores u oligonucleótidos. Desoxinucleótidos trifosfatados (dNTP). Cloruro de magnesio (MgCl2). Agua. Buffer o tampón. Potenciadores y aditivos. Cloruro de sodio (NaCl2). Hidróxido de sodio (NaOH).

Relaciona los componentes necesarios para la realización de la PCR. ADN molde. ADN polimerasa termoestable. Cebadores, primers, iniciadores u oligonucleótidos. Desoxinucleótidos trifosfatados (dNTP). Cloruro de magnesio (MgCl2). Agua. Buffer o tampón.

El conjunto de todos estos componentes para llevar a cabo la PCR, menos ADN molde y ADN polimerasa, se conoce como:

La PCR se lleva a cabo en un ______________ que me permite programar ciclos repetidos con la Tºs y tiempos de incubación.

Etapas principales de la PCR. Desnaturalización. Hibridación (annealing). Elongación o extensión. Centrifugación. Aislamiento celular. Extracción. Purificación.

Relaciona. Desnaturalización. Hibridación (annealing). Elongación o extensión.

Relacion. Desnaturalización ADN. Hibridación (annealing). Elongación o extensión.

Después del 1º ciclo (desnaturalización, hibridación y elongación), el fragmento de ADN se duplica y estará disponible para volverse a replicar en el 2º ciclo. Verdadero. Falso.

Cuantas veces se repite el ciclo básico de la PCR, amplificando en cadena el fragmento de ADN inicial. 30-40 veces. 10-20 veces. 20-30 veces. 1-10 veces.

El final del ciclo básico de la PCR siempre resulta en: doble de secuencias que la anterior (amplificación exponencial). triple de secuencias que la anterior (amplificación exponencial). doble de secuencias que la anterior (amplificación lineal). triple de secuencias que la anterior (amplificación lineal).

Un único fragmento de una muestra de ADN se amplifica por PCR durante 25 ciclos. ¿Cuántos amplicones se generatán?. 33554432. 50. 625. 2500.

En el procedimiento PCR estándar, se siguen los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Realizar una 2ª amplificación empleando el 1er producto de amplificación como molde. Es una doble PCR: 1º una convencional, 2ºPCR a partir del producto obtenido en la 1ª. Se usa cuando hay poco ADN en la muestra, para mejorar la especificidad, sensibilidad y el rendimiento. Emplea 2 parejas de primers: 1 externo (1ª PCR) y otra interna (2ª PCR) Inconveniente: requiere más manipulación, implicando más riesgo de contaminación. NestedPCR o PCR anidada. RT-PCR. Múltiplex PCR. PCR a tiempo real o PCR cuantitativa.

La PCR sólo amplifica ADN, por tanto, si tenemos ARN, es necesario sintetizar 1 molécula de ADN complementario que sirva de partida para la PCR convencional. Se emplea transcriptasa inversa (derivada de Thermus Thermophilus) que sintetiza ADN a partir de ARN. NestedPCR o PCR anidada. RT-PCR. Múltiplex PCR. PCR a tiempo real o PCR cuantitativa.

Amplifica simultáneamente varios fragmentos de ADN en la misma PCR (realiza múltiples PCRs al mismo tiempo) En la mezcla de reacción se introducen hasta 8 pares de primers, lo que equivale a realizar a la vez varias PCR. Reduce el tiempo y costes en el análisis de ANs. NestedPCR o PCR anidada. RT-PCR. Múltiplex PCR. PCR a tiempo real o PCR cuantitativa.

Monitorizar la amplificación de la molécula de ADN molde durante cada ciclo de amplificación y no al final. Se añaden a la mezcla reactivos fluorescentes (fluorocromos). Los termocicladores que realizan esta PCR incorporan un lector de fluorescencia que mide en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los tubos de reacción. Ventajas: rapidez (no necesita proceso adicional de detección) y, al ser un sistema cerrado, disminuye también el riesgo de contaminación. NestedPCR o PCR anidada. RT-PCR. Múltiplex PCR. PCR a tiempo real o PCR cuantitativa.

La ______________ en gel consiste en la migración de las moléculas cargadas en disolución en función del tamaño y carga eléctrica.

Es cierto en cuanto a la electroforesis: Consiste en la migración de las moléculas cargadas en disolución en función del tamaño y carga eléctrica. La corriente eléctrica mueve las moléculas a través del gel. Las moléculas con carga eléctrica + (cationes) irán hacia el ánodo y las de carga - (aniones) migrarán hacia el cátodo. Los poros del gel permitirán que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las moléculas más grandes. El uso de estándares de tamaño conocido del mismo gel determinará el tamaño de las moléculas por comparación.

Los componentes de una electroforesis son: Cubeta de electroforesis. Soporte electroforético. Fuente de alimentación. Buffer o tampón de electroforesis. Marcador de PM. Buffer de carga de la muestra. Campo magnético. Cámara hiperbárica.

Relaciona los componentes de una electroforesis con su descripción: Cubeta de electroforesis. Soporte electroforético. Fuente de alimentación. Buffer o tampón de electroforesis. Marcador de PM. Buffer de carga de la muestra.

El soporte electroforético donde se sitúa la muestra durante la separación de que tipo son: 1- Papel o acetato de celulosa: el mecanismo de separación es la carga (la muestra queda sobre la S y avanza con escasa fricción). 2- Gel de agarosa o poliacrilamida: medio semisólido o gelatinoso, la muestra queda embebida en el medio y avanzará a través de la malla o matriz 3D con elevada fricción. La separación se produce en función de la carga, el tamaño y la forma. 1 y 2 son correctas. 1 y 2 son incorrectas.

Según donde se disponga el soporte en la cámara: hay cubetas electroforesis horizontal. hay cubetas electroforesis vertical. hay cubetas electroforesis transversal. hay cubetas electroforesis circular. hay cubetas electroforesis octogonal.

El Buffer o tampón de electroforesis más usados son: TAE (Tris-acetato y EDTA). TBE (Tris-Borato y EDTA). Gelatina. Glicerol. Sulfato amónico.

Características de los geles. Agarosa. Acrilamida.

El gel de agarosa soporta mayores voltajes que la acrilamida. Verdadero. Falso.

AGAROSA vs POLIACRILAMIDA. No tiene toxicidad. Según la concentración de agarosa empleada, permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados. Poder de resolución es menor. Una vez realizada la electroforesis, se pueden visualizar los fragmentos mediante la tinción del ADN. La tinción puede realizarse de 2 formas diferentes: 1. añadir una sustancia fluorescente (se ilumina con luz UV) durante la preparación del gel que se intercala entre las bases del ADN. 2. teñir el gel tras finalizar la electroforesis. Permite separar moléculas de menor tamaño con mayor poder de resolución. Permite elaborar geles con un amplio intervalo de tamaño de poro.

Tipos de electroforesis. Horizontal. Vertical.

Cuando se llena la cubeta parcialmente con el tampón de electroforesis (la parte superior del gel no queda cubierto). Se depositan las muestras en los pocillos secos para que el líquido no genere interferencias. Con las muestras cargadas, se corre unos minutos a poco voltaje y luego se cubre completamente en gel con el tampón. Electroforesis Horizontal en seco. Electroforesis Horizontal submarina. Electroforesis Vertical. Electroforesis Horizontal.

Cuando las muestras se colocan en el gel sumergido totalmente en buffer. Electroforesis Horizontal en seco. Electroforesis Horizontal submarina. Electroforesis Vertical. Electroforesis Horizontal.

Se usa con geles de acrilamida para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tamaño. El gel está entre 2 placas rectangulares y la corriente eléctrica se genera gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas del ánodo y el cátodo. Las muestras se depositan con micropipeta llenando un “pocillo”. Electroforesis Horizontal en seco. Electroforesis Horizontal submarina. Electroforesis Vertical. Electroforesis Horizontal.

Procedimiento general de una electroforesis. 1. 2. 3. 4. 5.

Factores que afectan a la migración del ADN en una electroforesis: Concentración de gel usado. Tamaño de la molécula de ADN de la muestra. Tº y composición del buffer de electroforesis. Contaminación de la muestra. La velocidad de migración. El color de la tinción.

Una vez terminada la electroforesis, podemos examinar el gel y saber el tamaño de los fragmentos de ADN. Para visualizar los fragmentos, hay que realizar la tinción del ácidos nucleicos con _____________.

El bromuro de etidio es un reactivo muy tóxico y mutagénico, por lo que su uso debe sustituirse por alternativas actuales menos tóxicas. Verdadero. Falso.

En la tinción de geles de agarosa, los ácidos nucleicos pueden visualizarse con colorantes luminiscentes, va a permitir evaluar su integridad y estimar la concentración mediante comparación con marcador de pesos moleculares. Verdadero. Falso.

Los colorantes usados en la tinción de geles de agarosa se intercalan entre __________________ del ADN y emiten fluorescencia al exponerse con luz UV. las bases nitrogenadas. las bases nucleótidas. los ácidos nitrogenados. los ácidos nucleótidos.

Formas de tinción de los geles de agarosa. Preparar el gel con el agente intercalante incorporado (bromuro de etidio o similar). Una vez finalizada la electroforesis, teñir el gel con una solución de bromuro de etidio o similar. A mitad de la electroforesis, añadir bromuro de etidio o similar poco a poco. Preparar el gel con el agente intercalante incorporado (bromuro de sodio o similar). A mitad de la electroforesis, añadir bromuro de sodio o similar poco a poco.

Equipo que permite visualizar los fragmentos de ácidos nucleicos en el gel de agarosa después de la electroforesis y obtener una fotografía de él para su análisis. Documentador de geles. Escáner de geles. Fotografiador de geles. Paginación de geles.

Un equipo de análisis de geles consta de: Transiluminador de luz ultravioleta. Equipo de fotografía. Amplificador de luces LED. Visor microscópico.

Relaciona cada parte del documentador de geles: Transiluminador de luz ultravioleta. Equipo de fotografía.

Los resultados de una PCR se visualizan x electroforesis en un gel incluye un ___________ para determinar el tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR. marcador de peso molecular. marcador de concentración. marcador de presión. marcador de volumen.

Procedimiento de visualización e interpretación de resultados. 1. 2. 3. 4. 5.

Aplicaciones diagnósticas y forenses de la PCR. Enfermedades infeccionas. Enfermedades genéticas. Enfermedades oncológicas. Huella digital genética. Prueba de paternidad.

Aplicaciones diagnósticas y forenses de la PCR. Diagnóstico clínico. Genética forense.

La PCR ha adquirido un gran valor diagnóstico en los laboratorios de microbiología: permite detectar con gran sensibilidad y rapidez agentes etiológicos, genotipos de virulencia y resistencias. Enfermedades infecciosas. Enfermedades genéticas. Enfermedades oncológicas. Huella digital genética. Pruebas de paternidad.

La PCR permite detectar alteraciones o variaciones en la constitución genética de un individuo directa o indirectamente relacionadas con determinados estados patológicos. En la actualidad, este análisis se lleva a cabo en los laboratorios gracias a la PCR y con fines clínicos o investigación. Enfermedades infecciosas. Enfermedades genéticas. Enfermedades oncológicas. Huella digital genética. Pruebas de paternidad.

La PCR permite analizar mutaciones genéticas supresores y oncogenes, para el diagnóstico del cáncer o predecir la respuesta de las células tumorales a fármacos antineoplásicos. Enfermedades infecciosas. Enfermedades genéticas. Enfermedades oncológicas. Huella digital genética. Pruebas de paternidad.

Técnica forense que permite identificar a una persona comparando su ADN con una muestra obtenida. Enfermedades infecciosas. Enfermedades genéticas. Enfermedades oncológicas. Huella digital genética. Pruebas de paternidad.

Al poseer una tasa de mutación muy baja, las características de los microsatélites (STR) son idóneas para estas. Enfermedades infecciosas. Enfermedades genéticas. Enfermedades oncológicas. Huella digital genética. Pruebas de paternidad.

Presencia de 2 o más formas variantes de una secuencia específica de ADN que puede producirse entre diferentes personas.

Especialidad de la medicina legal que utiliza la BM para realizar el análisis genético de la diversidad humana y así, solucionar problemas judiciales.

Las técnicas de BM han permitido a la genética forense el análisis directo del ADN y de sus regiones _________.

Problemas que se resuelven en un lab de genética forense son: Investigaciones biológicas de paternidad. Análisis de muestras biológicas de interés criminal: sangre, esperma, saliva, pelos…. Identificación de restos cadavéricos de individuos o de fragmentos corporales en catástrofes. Enfermedades oncológicas. Enfermedades infecciosas. Enfermedades genéticas.

Conjunto de polimorfismos específicos de cada individuo (que le caracterizan).

Como las muestras obtenidas son muy abundantes, por PCR se aumentaría la cantidad de ADN y se amplificarían los segmentos polimórficos variables en la población. Verdadero. Falso.

Los individuos de la misma especie comparten gran parte de la secuencia de ADN y, según su función, podemos distinguir 2 tipo de secuencias: ADN codificante. ADN no codificante.

El ADN repetitivo en _____________ es el más usado con fines forenses, que son repeticiones de fragmentos de ADN de nº variable.

Son polimórficos (variables entre los individuos) poseen una herencia mendeliana simple (tendrá de su madre y de su padre). minisatélites. microsatélites o STR. mástersatélites. milisatélitels.

Relaciona. minisatélites. microsatélites o STR.

Es falso en cuanto a la prueba de paternidad. Al poseer una tasa de mutación muy baja, las características de los microsatélites (STR) son idóneas para las pruebas de paternidad. La PCR permite amplificar estos segmentos polimórficos del ADN de la madre, padre y niño/a. Se comparan los alelos que presenta el hijo/a para una serie de microsatélites (aprox 15) con los de los supuestos padre y madre y se comprueba la compatibilidad. Técnica forense que permite identificar a una persona comparando su ADN con una muestra obtenida.