BMC T16

Emplean una secuencia conocida de material genético, marcada para ser identificada, que se une a ADN o ARN para estudiar regiones del mismo. Por ello, su principal utilidad es la de determinar la presencia o ausencia de regiones particulares de ácidos nucleicos.

Hibridación con sonda se puede emplear en: a. El estudio de _____ _______, como por ejemplo el estudio de las alteraciones estructurales cromosómicas. b. El estudio de _______ _______ , poniendo de manifiesto partes del material genético del organismo infeccioso en la muestra de estudio. c. El estudio de _______ ______ cuantificando el ARNm que codifica para la expresión de un gen concreto. d. Estudios de ___________, estudiando secuencias de ADN y sus aplicaciones, por ejemplo, comparando las de diferentes individuos y estableciendo patrones evolutivos.

Es el fragmento de ácido nucleico conocido que se marca con una sustancia para permitir detectarla después, y que se une al ácido nucleico que queremos estudiar.

Las sondas pueden ser ácidos nucleicos de doble hebra o monocatenarias, pero funcionales solo son cuando tienen _____ _____, por lo que si son _________ deben ___________ primero. Además, pueden ser tanto de ADN como de ARN u oligonucleótidos, pudiendo unirse tanto a ADN como a ARN.

Obtenidas a partir de clonación o productos de PCR. SONDAS ADN. SONDAS ARN. SONDAS OLIGONUCLEOTIDOS.

Suelen ser bicatenarias. SONDAS ADN. SONDAS ARN. SONDAS OLIGONUCLEOTIDOS.

Se obtienen al transcribir una molécula de ADN clonado. SONDAS ADN. SONDAS ARN. SONDAS OLIGONUCLEOTIDOS.

Suelen ser monocatenarias. SONDAS ADN. SONDAS ARN. SONDAS OLIGONUCLEOTIDOS.

Fragmentos de ADN monocatenario de entre 15 y 50 nucleótidos,. SONDAS ADN. SONDAS ARN. SONDAS OLIGONUCLEOTIDOS.

Sintetizados con la secuencia específica complementaria a la región que se desea hibridar. SONDAS ADN. SONDAS ARN. SONDAS OLIGONUCLEOTIDOS.

Es crucial, ya que permite hacer visible a la sonda y poder valorar si se ha producido la hibridación y cómo lo ha hecho.

Normalmente se emplea para incorporar a la sonda nucleótidos diferenciados en sus grupos fosfato con algún tipo de marca.

Se incorporan al ADN POLIMERASA para marcar Isótopos radiactivos: (orden alfabético).

Se incorporan al ADN POLIMERASA para marcar Marcadores no radiactivos: (orden alfabético).

Este tipo de marcaje es el más empleado actualmente. Cuando lo que se detecta no es directamente la sustancia de marcaje, sino el producto de la interacción o reacción química entre esta y otra sustancia. MARCAJE CON SONDA CON ISOTOPOS RADIACTIVOS. MARCAJE CON SONDA CON MARCADORES NO RADIACTIVOS.

Se conoce como marcaje indirecto. MARCAJE CON SONDA CON Isótopos RADIACTIVOS. MARCAJE CON SONDA CON MARCADORES NO RADIACTIVOS.

Consiste en cortar fragmentos de ADN con una ADNasa que, mediante un ADN polimerasa de E. coli, añade nucleótidos marcados mientras que elimina los originales por su actividad también exonucleásica. Marcado por traslación de mellas. Marcado por cebado al azar. Marcado en los extremos.

Se desnaturaliza ADN de doble cadenay mediante un ADN polimerasa se van incorporando fragmentos de 6 nucleótidos (hexanucleótidos) que pueden tener nucleótidos marcados o no. Se produce una unión aleatoria y uniforme de las sondas al ADN. Marcado por traslación de mellas. Marcado por cebado al azar. Marcado en los extremos.

Esta se emplea para fragmentos pequeños, marcando uno o varios de los nucleótidos terminales. Marcado por traslación de mellas. Marcado por cebado al azar. Marcado en los extremos.

Los distintos tipos de hibridación tienen una serie de fases en común, que son: 1. __________ o _________ del material genético (sonda) de la muestra. Si es bicatenario debe, además, desnaturalizarse. 2. ________ de la ________ (que tenemos marcada previamente) a la muestra que queremos estudiar. 3. _________ entre la sonda y el ácido nucleico a estudiar, que se realiza por complementariedad de sus bases nitrogenadas. 4. _________, para eliminar las sondas que no se han unido. 5. _________, evidenciando la unión entre la sonda y el ácido nucleico (se comprueba si ha habido unión o no).

Transferencia e hibridación de ácidos nucleicos. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

Técnicas de hibridación en cromosomas y tejidos. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

Técnicas de transferencia e hibridación de ácidos nucleicos. Técnica de Southern Blot. técnica de Northern Blot. Microarrays. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH). Hibridación fluorescente in situ o Fish.

Técnicas de hibridación en cromosomas y tejidos. Técnica de Southern Blot. técnica de Northern Blot. Microarrays. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH). Hibridación fluorescente in situ o Fish.

Es aquella en la cual, tras extraer los ácidos nucleicos, se unen a un soporte , como pueden ser los chips. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

Se realiza la hibridación directamente sobre el tejido o la extensión cromosómica. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

Se extrae ADN, se fragmenta mediante la acción de enzimas y se practica una electroforesis. Esto nos permite separar los fragmentos de ADN por tamaño. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Mediante la ayuda de HCl y NaOH se desnaturaliza el ADN y se transfiere a un soporte sólido. Este soporte se incuba con la sonda marcada y después se lava la sonda que no se ha unido. •  Después, se realiza la detección. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Su principal aplicación es el estudio de los fragmentos de ADN obtenidos para valorar alteraciones en los mismos. También se puede emplear en investigación y estudio de genes. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

En el caso de esta técnica se estudia ARN, habitualmente ARNm. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Se extrae el ARN y se separa mediante electroforesis. Como en el caso anterior, se transfiere el ARN a un soporte sólido, fijándolo al mismo e hibridándose con la sonda previamente marcada. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Su utilidad está enfocada a la expresión génica, para comprobar si la expresión de un determinado gen es correcta. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Permite análisis simultáneos de múltiples fragmentos de ácidos nucleicos, realizando así estudios de alto rendimiento. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Se utilizan chips que llevan multitud de sondas adherida. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

Permite estudios de alto rendimiento. Técnica de Southern Blot. Técnica de Northern Blot. Microarrays.

ARRAYS: para valorar la expresión de múltiples genes, a partir de ARNm que se transcribe a ADNc. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

ARRAYS: permite estudiar el microARN (miARN), que es un tipo de ARN que interviene en la regulación de la expresión de hasta el 60 % de los genes. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

Es un tipo de ARN que interviene en la regulación de la expresión de hasta el 60 % de los gene.

ARRAYS: empleados para valorar la mayoría del genoma y, además, a qué regiones del mismo se unen determinadas proteínas. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

ARRAYS: permite detectar alteraciones en el número de copias del material genético, como por ejemplo deleciones y duplicaciones. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

Mediante la ayuda de _____ y _____ se desnaturaliza el ADN y se transfiere a un soporte sólido. Este soporte se incuba con la sonda marcada y después se lava la sonda que no se ha unido.

Consiste en hibridar ADN con sondas fluorescentes, es decir, que llevan fluorocromos. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

Estas sondas pueden unirse a regiones específicas como locus determinados o el centrómero de los cromosomas, o también hacerlo de manera general a todo el cromosoma. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

Lo habitual es emplear células en metafase, aunque recientemente se incluyen técnicas que emplean células en interfase, algo muy interesante para estudiar células con baja tasa mitótica. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

La coloración se produce gracias a una reacción inmunohistoquímica, visible con un microscopio convencional. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

Utilizado para la detección de secuencias génicas virales. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

Se utilizan para la detección de ARNm de inmunoglobulinas para valorar infiltrados de linfocitos y Estudios de expresión génica, detectando ARNm. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

Empleando como cromógeno sustancias con plata. Hibridación fluorescente in situ o Fish. Hibridación In Situ Cromogénica (CISH). Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH).

FISH: Lo habitual es emplear células en _________, aunque recientemente se incluyen técnicas que emplean células en _______*, algo muy interesante para estudiar células con _____ _____ ______.

FISH: Esta técnica se divide en 4 etapas: 1. ____________ y __________ de la muestra, con formaldehído al 4 % unas 4 horas a 4º C. 2. _________ con sonda marcada. 3. _________ de contraste con DAPI. 4. _________ al microscopio de fluorescencia.

Esta técnica se divide en 4 etapas: 1. Preparación y fijación de la muestra, con __________ al _ % unas _ horas a _º C. 2. Hibridación con sonda marcada. 3. Tinción de contraste con ______. 4. Visualización al microscopio de fluorescencia.

Contemplan la unión de un anticuerpo a la sonda, concretamente a una molécula con la que esta ha sido marcada. Esta unión será la que permita visualizar la sonda marcada.

Ofrece el color en la hibridación cromogénica.

REACCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA Un ejemplo sería el empleo de sondas marcadas con ______. A esta se une un __________ _______y a este un _________ ______ con _______. A continuación, entra en juego la ________ (proteína con elevada afinidad por la biotina), que está unida a una enzima, ________ o ___________ ________Finalmente, se añade el ______ que, al reaccionar con la enzima en cuestión, origina el producto, el __________, que le ofrece a la muestra el color. ANTICUERPO_SECUNDARIO CROMOGENO ESTREPTAVIDINA ANTICUERPO_PRIMARIO PEROXIDASA SUSTRATO FOSFATASA_ALCALINA DIGOXIGENINA BIOTINA.

Hibridación fluorescente in situ. Secar Lavar_alcohol_70% Teñir_DAPI Tampón_de_lavado_48ºC Fijación_con_formaldehído_al_4%,_4ºC_durante_4h Deshidratar:etanol Secar Cámara_de_hibridación_2h Lavar_agua_mili-Q Eliminar_tampón_de_lavado Observar Tampón_de_hibridación Secar Sonda_marcada.

Permite observar células en división, parafinadas o congeladas. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

Es muy útil para el estudio de aneuploidías. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

Su principal desventaja es que su precisión puede alterarse por la calidad de los reactivos empleados, de la sonda, de la fijación y la temperatura de desnaturalización. Hibridación en soporte sólido. Hibridación fluorescente in situ (FISH).

ARRAYS:hibridación genómica comparada. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

ARRAYS: se hibridan dos muestras con material genético, uno conocido y otro a analizar para, posteriormente, comparar qué cantidad de ADN ha hibridado con las respectivas sondas marcadas. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

Los resultados se interpretan comparando la cantidad de color que se obtiene en cada una de las muestras hibridadas. Para ello: Se emplea un colorante rojo para las hebras de ADN en estudio. Se emplea un colorante verde para las hebras de ADN de referencia. Expresión génica. Chip-on-chip:. CGH:.

CGH: En caso de que haya pérdida de material genético predominará el color ______ del ADN control. VERDE. ROJO.

El _____ ________ es muy importante, ya que en esta fase se pretende mantener los híbridos que se han formado entre las sondas y las secuencias diana y eliminar los híbridos imperfectos. De su correcta realización depende la especificidad de la técnica.

Se realiza el lavado con un __________. Este debe tener las denominadas condiciones de rigurosidad, mediante una combinación de temperatura, fuerza iónica y concentración de formamida.

Registro de resultados: Se realiza mediante autorradiografía, empleando rayos X sobre el soporte en el que se realiza la hibridación. Al revelarse la placa se observan puntos, manchas o bandas oscuras en el caso de que sea positiva. Marcaje radioactivo. Fluorocromos:. Haptenos:.

Registro de resultados: se emplea en las técnicas de hibridación in situ. Las muestras se llevan al microscopio de fluorescencia donde se excitan con una longitud de onda apropiada, produciendo la emisión fluorescente del marcador, lo que permite su observación. Marcaje radioactivo. Fluorocromos:. Haptenos:.

Registro de resultados: se utilizan en todo tipo de técnicas. Para detectar las sondas se emplea un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo (microscopía de fluorescencia) o una enzima que cataliza una reacción con un producto coloreado (microscopía convencional). Marcaje radioactivo. Fluorocromos:. Haptenos:.