Métodos: Tema 2 (solo está el vídeo del Aula Virtual)

Selecciona la afirmación incorrecta, si la hay, sobre la extracción del DNA: La extracción del DNA consiste en el aislamiento del DNA de las células, para su posterior corte en posiciones específicas. Tiene muchas aplicaciones, como la tecnología del DNA recombinante. Diferentes tipos celulares requieren diferentes tipos de extracción de DNA. En todo caso, la extracción consiste en 4 pasos estándar: lisis celular, lisis nuclear, eliminación de proteínas y recuperación de DNA. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Selecciona la afirmación incorrecta, si la hay, sobre la extracción de DNA en células eucariotas: Como el DNA está empaquetado en el núcleo, se debe romper tanto la membrana celular como la nuclear para poder aislarlo. La lisis celular se llevaba a cabo en el pasado de forma mecánica, mediante molido o sonicación. La lisis celular se puede llevar a cabo de forma química, mediante detergentes y enzimas que disuelven partes de la membrana celular. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Selecciona la afirmación incorrecta, si la hay: En una extracción de DNA, una vez realizada la lisis celular... 1°) Los contenidos celulares son liberados. Para separar los restos (debris) de los componentes solubles, llevaremos a cabo una centrifugación. En el sobrenadante quedarán ácidos nucleicos y proteínas hidrosolubles. 2°) Para eliminar las proteínas, se añaden enzimas (proteinasa K, peptidasa, lisozima) al sobrenadante para romper las uniones peptídicas. 3°) El DNA se recupera del sobrenadante mediante precipitación (utilizando alcohol y sales, como acetato sódico). 4°) El precipitado aislado se disuelve en agua o un tampón. No la hay, todas son correctas.

Ordena las etapas secuenciales de los métodos de extracción de DNA (extracción de ácidos nucleicos): 1°. 2°. 3°. 4°. 5°.

Nombra las etapas secuenciales de los métodos de extracción del DNA:

Di cuál de estas afirmaciones sobre la extracción de ácidos nucleicos es incorrecta, si la hay: Para su estudio, el DNA tiene que estar en su estado polimerizado. Las soluciones de lisis química están compuestas por detergentes aniónicos (SDS). Las soluciones penetran en las células y generan desestabilización osmótica, hinchando y haciendo estallar su membrana. Las soluciones de lisis química contienen agentes quelantes (EDTA) que se utilizan para minimizar el daño al DNA derivado del estallido de la célula. Las soluciones de lisis química contienen una solución tampón o buffer de Tris-HCl a pH 3,5 a 5,5 para acidificar y desnaturalizar las proteínas expulsadas en la lisis. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Describe qué está ocurriendo en esta imagen:

Selecciona cuál de estas afirmaciones sobre la extracción de ácidos nucleicos es incorrecta, si la hay: "Otros métodos de lisis celular son...". Métodos químicos: Detergentes (el más simple), choque osmótico o tratamiento alcalino. Métodos físicos: Deforman las células (en fase sólida o líquida) bacterianas o vegetales con pared, que ayuda a la membrana a soportar el jabón (homogenización mecánica o en solución, pulverización en mortero, perlas de vidrio, sonicación...). Métodos enzimáticos: Método poco costoso. Las enzimas rompen tejidos compactos y células con paredes. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Relaciona el método de lisis celular con su método de actuación: Baño de sonicación. Enzima proteinasa K. Enzima tripsina. Enzima colagenasa. Enzima lipasa. Enzima lisozima. Enzima liticasa. Enzima zimolasa.

Completa la imagen sobre la extracción de ácidos nucleicos:

Selecciona la afirmación incorrecta, si la hay, sobre la extracción de ácidos nucleicos, específicamente, sobre la remoción de proteínas y contaminantes: El DNA liberado debe ser separado de posibles contaminantes (RNA o proteínas). Las proteínas quedan en el fondo, pero el RNA sí debe ser separado mediante soluciones desnaturalizantes (NaCl u otra sal neutra). Para mantener la pureza del DNA se deben eliminar restos celulares y contaminantes como lípidos, carbohidratos, proteínas e iones del medio. El perclorato de sodio ayuda a disociar las proteínas unidas al ácido nucleico; y el fenol y cloroformo, a desnaturalizar y precipitar proteínas. (IMPORTANTE). No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Nombra las partes de la extracción de ácidos nucleicos (remoción de proteínas y contaminantes):

Relaciona cada químico con su papel en la extracción de ácidos nucleicos (concentración o precipitación del DNA): Isopropanol. Etanol absoluto. Acetato de sodio. EDTA. Etanol.

¿Qué pasos tengo que seguir para extraer ácidos nucleicos?:

Nombra las partes de esta fase del proceso de extracción de los ácidos nucleicos:

Selecciona cuál de estas afirmaciones sobre la extracción de ácidos nucleicos (específicamente sobre el lavado y la hidratación del DNA) es falsa, si es que hay alguna que lo es: El DNA se lava con solución de etanol al 70% en agua (30%), que elimina las sales usadas en el proceso y que siguen en contacto con el DNA en el pellet, después de su extracción y purificación. El DNA se resuspende o hidrata en una solución de Tris-EDTA, que lo protege. Existen kits para el aislamiento de DNA de animales y vegetales, con sus ventajas e inconvenientes. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Sobre los fundamentos de los métodos de extracción y separación, cita qué 5 métodos hay:

Selecciona cuál de estas afirmaciones sobre el "Salting Out" es incorrecta, si la hay: La solubilidad de las proteínas disminuye a altas concentraciones de sales. A más aminoácidos hidrofílicos haya, más difícil será precipitarlos, por su capacidad de unirse a moléculas de agua. Aunque es verdad que a más átomos de sal, más difícil se hace este enlace. La proteína se enlazará a sí misma en un enlace covalente y precipitará. El DNA quedará protegido por una capa iónica que formará la sal a su alrededor y permanecerá en la solución.

Describe el proceso del "Salting Out":

Señala las partes de este "Salting Out" en eritrocitos:

Señala cuál de estas afirmaciones sobre el Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio (CTAB) es incorrecta, si es que la hay: Es una sal de amonio cuaternario con un grupo alquilo de gran magnitud molecular. Se usa normalmente para muestras animales, con gran cantidad de polisacáridos y polifenoles. Presenta propiedades detergentes. Se conocen como jabones invertidos o detergentes catiónicos, porque su actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como en el SDS, u otros detergentes. No hay ninguna incorrecta, todas son correctas.

¿Qué es esta molécula?:

Une el compuesto químico con el uso que se le da: 1°) Liberación de ácidos nucleicos. 2°) Purificación de ácidos nucleicos. 3°) Precipitación de DNA. 4°) Lavado de DNA.

Completa la imagen:

Relaciona, sobre el método del fenol-cloroformo: Fase superior (acuosa). Fase inferior. Interfase gruesa y blanquecina.

Describe el funcionamiento del método de Fenol-Cloroformo:

¿Para qué se puede añadir una pequeña cantidad de alcohol isoamílico en el método del Fenol-Cloroformo?:

Selecciona cuál de estas afirmaciones sobre las sales de guanidina DNAZOL es incorrecta (si es que la hay): Es un reactivo no tóxico y completo, para realizar aislamientos de DNA genómico de muestras sólidas y líquidas de origen bacteriano, animal y sobre todo vegetal. Es una sustancia caotrópica que favorece la disolución en agua de compuestos insolubles. Desestabiliza los enlaces de la célula y la lisa, hidrolizando el RNA y precipitando selectivamente el DNA. No la hay, todas las afirmaciones son correctas. Es necesario usar RNAsas para poder extraer el DNA.

Señala cuál de estas afirmaciones sobre las sales de guanidina TRIZOL es incorrecta (si es que la hay): Contiene fenol y una solución de Isocianato de guanidinio GI. El GI es una sal caotrópica que desnaturaliza DNA. El método sirve para obtener RNA total. El RNA es monocadena (no tiene tantas cargas negativas) y tiene las bases nitrogenadas expuestas. Por tanto, las cargas positivas de las bases junto con las cargas negativas del fosfato, permitirán la neutralización y harán que sea más soluble en agua y, por tanto, que se mantenga disuelto. (ESTE TIPO DE COSAS VAN PARA EXAMEN). Proteínas y DNA se quedan en la interfase; y RNA permanece disuelto en la solución. No la hay, todas las afirmaciones son correctas. El RNA disuelto en la solución se puede utilizar para realizar retrotranscripciones, entre otros. En este medio ácido, las cargas negativas del DNA quedarán bloqueadas con los protones.

¿Qué es cada parte? (Vaso de precipitados tras aplicar el TRIZOL y centrifugar):

¿Qué precauciones se deben tomar al trabajar con RNA?:

Señala la afirmación incorrecta sobre la cromatografía, si es que la hay: Es un método que se usa para separar ácidos nucleicos. Se basa en el intercambio reversible de iones en solución con grupos funcionales unidos covalentemente a la resina (fase estacionaria insoluble). Al final, el componente retenido es eluído (despegado de la columna) y disuelto en otro líquido por el que tiene más afinidad que por la fase estacionaria. Se utilizan columnas (tubos cromatográficos) que se recubren interiormente con la fase estacionaria insoluble (resina), que estará unida covalentemente a la pared del tubo y retendrá algún componente de la mezcla que la atraviese e “ignorará” los demás. Estos se recogerán en otro recipiente. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

Escribe las partes del proceso:

Utilizando como base la imagen, explica el funcionamiento de la cromatografía:

Une los pasos de la cromatografía de intercambio iónico con el orden en el que ocurren: 1°. 2°. 3°.

¿Puede separarse el DNA del RNA mediante una cromatografía de intercambio iónico?:

Usando de referencia la imagen, explica cómo funciona la cromatografía de intercambio iónico. ¿Qué representa la gráfica? :

Selecciona la afirmación incorrecta sobre la cromatografía de adsorción: Se usan columnas con fase estacionaria de sílice. No la hay, todas las afirmaciones son correctas. 1°) La sal caotrópica (NaI), que se encuentra a concentraciones muy elevadas, desorganizan la red 3D del agua e influye en su interacción con las macromoléculas a pHs ácidos. Le roba el agua al DNA y al RNA y los deja libres para unirse a la sílice y, por tanto, a la columna por adsorción. 2°) Eliminamos los contaminantes de la muestra con lavados de la columna y eluimos el DNA con agua o un tampón de alta fuerza iónica a pH ácido , ya que con el cambio de pH, el DNA deja de sentirse tan atraído por la sílice y eluye. En esta técnica, el RNA también debe ser eliminado mediante RNAsas.

¿Qué es este instrumento?:

Selecciona cuál de estas afirmaciones sobre la purificación de mRNA es incorrecta, si la hay: Tras la extracción, se debe llevar a cabo una purificación con fenol-cloroformo y después, una cromatografía de afinidad. 1°) Las columnas tienen en su interior fragmentos oligoDT (secuencias de T) u oligoDU, que interaccionan con las colas poliA del mRNA. 3°) Tras varios lavados que eliminen los contaminantes, el mRNA se eluye en un tampón. El mRNA purificado se utilizará para diversos estudios de mRNA y para la retrotranscripción. 2°) Solo el mRNA queda retenido en la columna, con el establecimiento de un "puente" mRNA-cola poliA + cola poliU-sílice-columna. El resto de sustancias (otros ácidos nucleicos y demás) caen. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.

¿Qué es el método que aparece en la imagen y para qué sirve?:

Señala cuál de estas afirmaciones sobre el método de la separación magnética es incorrecta, si la hay: 1°) Usa esferas magnéticas cuya superficie está recubierta con polímeros de alta afinidad por los ácidos nucleicos, que se añaden al lisado de la muestra, permitiendo su unión al DNA. 3°) Los contaminantes de la muestra en solución son eliminados por pipeteo o decantación. 4°) Tras varios ciclos de resuspensión y lavado en los que las esferas quedan retenidas por el imán, el DNA es eluído en un tampón. No la hay, todas las afirmaciones son correctas. 2°) Se sitúa un imán en la pared o base del tubo, para agrupar allí las esferas con DNA unido.

¿Qué es este método? Explica sus pasos:

Para cuantificar la cantidad y calidad del ácido nucleico extraído (o sintetizado), ¿qué 2 técnicas se suele usar? ¿En qué se basan?:

Señala cuál de estas afirmaciones sobre la espectrofotometría como método de cuantificación de ácidos nucleicos es incorrecta, si la hay: Medida de la cantidad de luz infrarroja que absorben las bases nitrogenadas, mediante el uso de un espectrofotómetro. A la longitud de onda existe una relación lineal de proporcionalidad absorción-concentración de DNA. Así que la lectura a esta longitud permitirá calcular la concentración de AN en la muestra. La sensibilidad es muy elevada (hasta 2 µg/ml de DNA). Los ácidos nucleicos (AN) tienen un máximo de absorción a una longitud de onda de 260 nm. No la hay, todas son correctas.

¿Cuál es la fórmula para el cálculo de la [DNA] a partir de la absorbancia de la muestra?.

Se toma como referencia que una Densidad Óptica OD260 (subíndice), corresponde aproximadamente a: 50 µg/ml de DNA de doble cadena. 40 µg/ml de RNA de DNA de cadena sencilla. 20 µg/ml de oligonucleótidos. 60 µg/ml de DNA de doble cadena. 50 µg/ml de RNA de DNA de cadena sencilla. 10 µg/ml de oligonucleótidos.

Explica los pasos de la espectrofotometría como método para la cuantificación de ácidos nucleicos:

Problema de espectrofotometría (cuarto paso de la cuantificación de ácidos nucleicos): Sabiendo que la A260 (subíndice) del problema es de 0'05 y la A260 del blanco es de 0'01, que el factor de dilución es de 1:200 y que una unidad de absorbancia son 50 µg/ml (absorbancia patrón: 50 µg/ml de DNA de doble cadena), calcula la A260 del DNA:

Completa la imagen. ¿Cuál es la función de esta gráfica?:

¿Cómo podemos conocer la calidad de los ácidos nucleicos tras la realización de una espectrofotometría?:

¿A qué nos referimos cuando hablamos de que un ácido nucleico está contaminado?:

Señala cuál de estas afirmaciones sobre la fluorescencia como método para la cuantificación de ácidos nucleicos es incorrecta, si es que la hay: En la fluorescencia, se absorbe luz a una longitud de onda y se devuelve a otra diferente. El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente que se intercala entre las bases del DNA, aumentando con ello mucho su emisión de fluorescencia. No la hay, todas son correctas. La fluorescencia obtenida es proporcional a la cantidad de DNA presente. Es un método muy sensible y específico del DNA; y muy útil en electroforesis.

¿A qué método se hace referencia con esta gráfica? ¿Por qué ocurre esto?:

Cita qué aplicaciones puede tener el aislamiento y la purificación de los ácidos nucleicos.

Selecciona la afirmación incorrecta sobre las aplicaciones en paleontología y las distintas características de la extracción de DNA de fósiles: 1) La extracción de DNA de fósiles permite estudiar la genética de especies extintas, la evolución y la historia de la vida en la Tierra. 2) El DNA de fósiles antiguos será fragmentario y estará en mal estado, muy degrado. Se necesitan métodos muy sofisticados para su extracción y mucho cuidado para no terminar de degradarlo en su manipulación. 3) A la hora de elegir un fósil, los ideales serían los conservados en condiciones muy buenas (permafrost o ámbar), que pueden preservar el DNA durante miles o millones de años. 4) El material genético antiguo se mezcla y contamina con DNA moderno en la muestra. 5) Pese a los avances científicos, el material genético de huesos y dientes fosilizados permanece sin poderse extraer. 3, 4 y 5 son falsos.

Selecciona la afirmación incorrecta, si es que la hay, sobre una aplicación: el DNA ambiental: Se basa en recolectar grandes muestras o rastros de DNA, que extraeremos, secuenciaremos, analizaremos, identificaremos y caracterizaremos mediante técnicas muy complejas de última generación. Se encuentra en suelo, agua, aire, heces, restos, etc. Permite detectar múltiples especies (especies difíciles de observar o en áreas remotas: marinas o en ambientes extremos) en una sola muestra, informando sobre la diversidad biológica de un área determinada. Se usa para monitorear cambios en la biodiversidad en el tiempo, lo que ayuda a tomar decisiones de conservación. Identifica especies invasoras, aplicaciones en la conservación de especies en peligro de extinción, etc. No la hay, todas las afirmaciones son correctas.