PROCESAMIENTO TEMA 4

ELEMENTOS BÁSICOS DE UN MICROTOMO. 1. 2. 3. 4. 5.

TIPOS DE MICROTOMOS. MICROTOMO DE OSCILACIÓN O BALANCEO. MICROTOMO DE ROTACIÓN O TIPO MINOT.

ULTRAMICROTOMO: Para microscopía electrónica. Permite obtener cortes de decenas de nanómetros a partir de bloques de plásticos. Para microscopía óptica. Permite obtener cortes de centenas de nanómetros a partir de bloques de plásticos. Un ordenador controla el avance del portabloques . Ajuste digital en pasos 1nm Microscopio estereoscópico incorporado. Una persona controla el avance del portabloques . Ajuste digital en pasos 1nm Microscopio estereoscópico incorporado.

TIPOS DE CUCHILLAS. BICÓNCAVA EN AMBAS CARAS. PLANOCÓNCAVA. BIPLANA, EN CUÑA O TIPO C. BIPLANA CON FACETAS O TIPO C.

PRECAUCIONES PARA CONSERVAR EN BUEN ESTADO LAS CUCHILLAS: Deben debastarse bloques realizando cortes de espesor superior 40-45 micras. Mantenerlas guardadas en su caja Limpiar con xilol el filo antes y despues de usarlas. No deben debastarse bloques realizando cortes de espesor superior 20-25 micras. Mantenerlas guardadas en su caja Limpiar con xilol el filo antes y despues de usarlas. Al limpiar evitar arrastrar cualquier cosa a lo largo del filo, incluso el papel. Evitar tocar el borde con objetos duros (pincel, pinzas) Uso sistemático, adquirir una rutina de trabajo: - Trabajar desde un extremo a otro. - Usar un lado para debastar y el otro para cortar, o usar cuchillas diferentes. Al limpiar arrastrar cualquier cosa a lo largo del filo, incluso el papel. Evitar tocar el borde con objetos duros (pincel, pinzas) Uso sistemático, adquirir una rutina de trabajo: - Trabajar solo un extremo. - Usar un lado para debastar y el otro para cortar, o usar cuchillas diferentes.

TÉCNICA DE CORTE DE BLOQUES DE PARAFINA. Pasos a seguir: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

RETALLADO. RETALLADO. ENFRIAMIENTO.

Orientación de la muestra y el bloque. Coolocar el bloque siempre con la misma orientación (xej. etiqueta hacia la izquierda). Comprobar el paralelismo entre la superficie del bloque y la cara interna de la cuchilla. Orientación preferente para algunos tipos de muestras (frente de ataque): - Intestino: la cuchilla pasa a través de la mucosa al final. - Cérvix: mejor presentar primero un punto de tejido denso más que un borde recto. - Piel: la cuchilla paa a través de la epidermis al final. Manipulación de la rótula del portabloques para corrección de la inclinación vertical y el ángulo horizontal.

Orientación del bloque. Coolocar el bloque siempre con la misma orientación (xej. etiqueta hacia la izquierda). Comprobar el paralelismo entre la superficie del bloque y la cara interna de la cuchilla. Orientación preferente para algunos tipos de muestras (frente de ataque): - Intestino: la cuchilla pasa a través de la mucosa al final. - Cérvix: mejor presentar primero un punto de tejido denso más que un borde recto. - Piel: la cuchilla paa a través de la epidermis al final. Manipulación de la rótula del portabloques para corrección de la inclinación vertical y el ángulo horizontal.

Orientación de la cuchill: hay 4 ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la cuchilla: Ángulo de inclinación. Ángulo de arrastre. Ángulo de corte. Ángulo libre.

ORIENTACIÓN DE LA MUESTRA. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Ángulos de control de la incidencia del corte: 1. 2. 3. 4.

Debastado del bloque. Eliminación de las capas superficiales de parafina situadas por encima del tejido hasta obtener un corte representativo. Esta etapa requiere de mucho cuidado: se puede perder fácilmente tejido importante para el diagnóstico o se puede dañar la superficie del bloque. Eliminación de las capas inferiores de parafina situadas por deajo del tejido hasta obtener un corte representativo. Esta etapa requiere de mucho cuidado: se puede perder fácilmente tejido importante para el diagnóstico o se puede dañar la superficie del bloque. Antes de iniciar el recorte, asegurarse siempre de que todos los mecanismos de sujeción están apretados con seguridad. El recorte normalmente se efectúa con unos grosores de entre 10 y 30 µm. Al efectuar un recorte basto y rápido de tejidos quebradizos se corre el riesgo de dañar la superficie de la muestra. Como paso final, pulir la cara del bloque cortando suavemente unas pocas secciones finas. Antes de iniciar el recorte, asegurarse siempre de que todos los mecanismos de sujeción están apretados con seguridad. El recorte normalmente se efectúa con unos grosores de entre 100 y 300 µm. Al efectuar un recorte basto y rápido de tejidos quebradizos se corre el riesgo de dañar la superficie de la muestra. Como paso final, pulir la cara del bloque cortando suavemente unas pocas secciones finas.

Selección del grosor del corte. Las secciones de parafina suelen tener un espesor de 3-5 µm Una sección cohesiva de 4 µm puede proporcionar más información que una sección de 2µm interrumpida severamente. Las secciones de parafina suelen tener un espesor de 7-8 µm Una sección cohesiva de 8 µm puede proporcionar más información que una sección de 10µm interrumpida severamente. Factores que influyen en el grosor de la sección real: - Dilatación por calor - Velocidad de rotación - Ángulo de incidencia - Condiciones de filo. Factores que influyen en el grosor de la sección real: - Dilatación por frío - Velocidad de rotación - Ángulo de incidencia - Condiciones de filo.

Realización de las secciones. La naturaleza del bloque y del tejido condicionan el ritmo y la velocidad de corte, que será inversamente proporcional a la dureza. La parafina fría proporciona un mejor soporte para los elementos duros en una muestra, permitiendo que se obtengan secciones mas delgadas. Usar una sección de la cuchilla que no haya sido utilizada para el desbastado. La naturaleza del bloque y del tejido condicionan el ritmo y la velocidad de corte, que será proporcional a la dureza. La parafina caliente proporciona un mejor soporte para los elementos duros en una muestra, permitiendo que se obtengan secciones mas delgadas. Usar una sección de la cuchilla que no haya sido utilizada para el desbastado. Evita cortar secciones gruesas involuntariamente, ya que esto podría dañar la cuchilla y, posiblemente, la cara del bloque. Si la cara del bloque se calienta o se requieren niveles mas profundos, puede ser necesario volver a enfriar. Generalmente, los mejores resultados y la menor compresión se obtienen con una carrera de corte uniforme y lenta. Evita cortar secciones finas involuntariamente, ya que esto podría dañar la cuchilla y, posiblemente, la cara del bloque. Si la cara del bloque se enfria o se requieren niveles menos profundos, puede ser necesario volver a calentar. Generalmente, los mejores resultados y la mayor compresión se obtienen con una carrera de corte uniforme y lenta.

Realización de las secciones. No parar ni reiniciar durante una carrera de corte ya que esto produciría franjas de diferentes grosores a lo largo de la sección. La aplicación de un aliento cálido y húmedo tiende a hacer las secciones más cohesivas, pero también ocasiona la dilatación a causa del calor, por eso, la sección se hace mas gruesa. Se puede parar y reiniciar durante una carrera de corte ya que esto no produciría franjas de diferentes grosores a lo largo de la sección. La aplicación de un aliento cálido y húmedo tiende a hacer las secciones más cohesivas, pero también ocasiona la dilatación a causa del calor, por eso, la sección se hace mas gruesa. Los residuos que se adhieren al borde superior o inferior del bloque o a la parte trasera de la cuchilla pueden dificultar la obtención de cintas cohesivas y ocasionar que la cinta se separe de la cuchilla en la carrera ascendente. Coloca los bloques sobre una placa fría o sobre una superficie fría y húmeda durante unos minutos. El agua penetra un poco en la cara del bloque, hinchando los tejidos y haciéndolos mas adecuados para cortarlos. Esto tiene particular importancia en el caso de tejidos excesivamente deshidratados, secos o que se desmigajan. Los residuos que se adhieren al borde superior o inferior del bloque o a la parte trasera de la cuchilla pueden dificultar la obtención de cintas cohesivas y ocasionar que la cinta se separe de la cuchilla en la carrera descendente. Coloca los bloques sobre una placa caliente o sobre una superficie caliente y seca durante unos minutos. El agua penetra un poco en la cara del bloque, hinchando los tejidos y haciéndolos mas adecuados para cortarlos. Esto tiene particular importancia en el caso de tejidos excesivamente deshidratados, secos o que se desmigajan.

Estirado de los cortes. Se trata de eliminar las arrugas que se hayan producido durante el corte. - Seleccionar la zona de mayor calidad de la cinta de cortes y estirar en un baño de agua caliente. - Tº 45º-50ºC. Oscilará entre 5º-9º por debajo de la temperatura de fusión de la parafina. Se trata de hacer arrugas después del corte. - Seleccionar la zona de menor calidad de la cinta de cortes y estirar en un baño de agua caliente. - Tº 85º-90ºC. Oscilará entre 15º-19º por debajo de la temperatura de fusión de la parafina. Se trata de hacer arrugas después del corte. - Seleccionar la zona de menor calidad de la cinta de cortes y estirar en un baño de agua fría. - Tº 45º-50ºC. Oscilará entre 5º-9º por debajo de la temperatura de fusión de la parafina. Se trata de eliminar las arrugas que se hayan producido durante el corte. - Seleccionar la zona de mayor calidad de la cinta de cortes y estirar en un baño de agua caliente. - Tº 85º-90ºC. Oscilará entre 15º-19º por debajo de la temperatura de fusión de la parafina.

Precauciones en el estirado: - Supervisar la TºC. - Agua limpia sin residuos de secciones anteriores ni burbujas. - Depositar las secciones con un movimiento de barrido suave. - Dejar el tiempo suficiente para estirar el corte. Tiempo excesivo puede dañar tejidos más sensibles. - Las secciones de 2 bloques diferentes no deben flotar simultáneamente. - No supervisar la TºC. - Agua sucia con residuos de secciones anteriores ni burbujas. - Depositar las secciones con un movimiento de barrido brusco. - Dejar el tiempo suficiente para estirar el corte. Tiempo insuficiente puede dañar tejidos más sensibles. - Las secciones de 20 bloques diferentes no deben flotar simultáneamente. - Supervisar la TºC. - Agua limpia sin residuos de secciones anteriores ni burbujas. - Depositar las secciones con un movimiento de barrido suave. - Dejar el tiempo suficiente para estirar el corte. Tiempo excesivo puede dañar tejidos más sensibles. - Las secciones de 20 bloques diferentes no deben flotar simultáneamente. - No Supervisar la TºC. - Agua sucia con residuos de secciones anteriores ni burbujas. - Depositar las secciones con un movimiento de barrido suave. - Dejar el tiempo suficiente para estirar el corte. Tiempo insuficiente puede dañar tejidos más sensibles. - Las secciones de 2 bloques diferentes no deben flotar simultáneamente.

Escurrir y secar las preparaciones. Capturar los cortes. Secado de las preparaciones.

DEFICIENCIAS DURANTE EL CORTE. Que se agriete la parafina Que el tejido se dedsprenda de la parafina Que la superficie de corte (tejido) aparezca agrietada o blanquecina Que aparezcan grietas en los cortes. Que los cortes se deshagan aunque el aspecto del tejido sea bueno (buena inclusión) Que los cortes se enrollen sobre la cuchilla Que no se forme la cinta de cortes Que el bloque arrastre consigo los cortes ya hechos. Que surjan estrías e los cortes Que los cortes salgan aplastados Que la cuchilla haga un corte sí uno no. Que los cortes se queden pegados a la cuchilla Que los cortes salgan vibrados. Todas son correctas.

DEFICIENCIAS DURANTE EL CORTE. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

DEFICIENCIAS DURANTE EL CORTE. SECCIÓN DEMASIADO GRUESA. OQUEDADES DEBIDO A UN RECORTE BASTO. LÍNEAS DE CUCHILLAS (ESTRÍAS VERTICALES). DISGREGACIÓN. PEQUEÑAS GRIETAS O MICRORUGOSIDADES. RUGOSIDAD BASTA - CORTE VIBRADO.

Técnica de corte para material incluido en celoidina.-. Conservación, tallado y fijación del bloque al microtomo. Microtomo. Orientación de la cuchilla y debastado. Obtención de las secciones y preparaciones. Coloración.

Técnica de corte sobre material congelado. Biopsias intraoperatorias. Todas son correctas. Criotomo o criostato. Microtomo de congelación clásico.

Microtomo de congelación.-. La congelación de los tejidos es una manera rápida de endurecerlos sin necesidad de inclusión, por lo que la preservación molecular es máxima. Muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. La congelación de los tejidos es una manera lenta de endurecerlos sin necesidad de inclusión, por lo que la preservación molecular es máxima. Muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. El tubo negro de la derecha es el encargado de enfriar el portabloques y la muestra (bloque rojo) a temperaturas inferiores a -20 °C. Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en un baño de agua fría para estirarlas. El tubo negro de la derecha es el encargado de enfriar el portabloques y la muestra (bloque rojo) a temperaturas inferiores a -40 °C. Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en un baño de agua fría para estirarlas.

Criostato.-. Para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm El sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya TºC se uede regular, normalmente entre -20º y -30ºC. Para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm El sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya TºC se uede regular, normalmente entre -40º y -50ºC. La congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se encuentra a una TºC inferior, en torno a -50ºC. Tambien se puede congelar el tejido externamente con la rápidez que deseemos, xej. con Nitrógeno líquido, pero es coveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta que consiga igualar su TºC con la de ésta para obtener secciones homogéneas. La congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se encuentra a una TºC inferior, en torno a -100ºC. Tambien se puede congelar el tejido externamente con la rápidez que deseemos, xej. con Nitrógeno líquido, pero es coveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta que consiga igualar su TºC con la de ésta para obtener secciones homogéneas. La preparación del bloque y el mecanismo de corte es similar al que se describió para el microtomo de rotación para parafina Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado y una vez secas puedem procesarse para las técnicas que deseemos. La preparación del bloque y el mecanismo de corte es diferente al que se describió para el microtomo de rotación para parafina Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado y una vez secas puedem procesarse para las técnicas que deseemos.

Ultramicrotomo. -Secciones ultrafinas 30- 120 nm. -Tipos de cuchillas: Cuchillas de vidrio y cuchillas de diamante. -Técnica de corte: requiere mucha práctica, la obtención de cortes ultrafinos es difícil. -Secciones ultrafinas 130- 320 nm. -Tipos de cuchillas: Cuchillas de plástico y cuchillas de diamante. -Técnica de corte: requiere mucha práctica, la obtención de cortes ultrafinos es difícil. -El ultramicrotomo debe estar en un lugar carete de vibraciones, a TºC constante y sin corrientes. -Retallar y debastar para crear una pirámide truncada. -El ultramicrotomo debe estar en un lugar carete de vibraciones, a TºC variable y con corrientes. -Retallar y debastar para crear una pirámide truncada. -Piramitomo: lima y crea las caras de la pirámide además de producir el debastado para obtener la superficie de corte. Este proceso debe ser preciso porque la superficie de corte debe ser muy grande (apróx. 0,5 mm2). -Piramitomo: lima y crea las caras del cuadrado además de producir el debastado para obtener la superficie de corte. Este proceso debe ser preciso porque la superficie de corte debe ser muy grande (apróx. 0,5 cm2).

ULTRAMICROTOMO Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Ultramicrotomo. Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte imprecisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de mismo grosor. El grosor de una sección ultrafina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. El grosor de una sección ultragruesa se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie.

Ultramicrotomo: El grosor de una sección ultrafina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie: Gris. Plata. Oro pálido. Oro intenso. Púrpura.

Ultramicrotomo.- Corte y recogida de las secciones en una rejilla. 1. 2. 3. 4. 5.