Técnicas de PCR

Técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.

Se han desarrollado diferentes variantes de la PCR que permiten: amplificar varios fragmentos iguales en una única reacción. Amplificar fragmentos de ARN. cuantificar la concentración de una molécula concreta de nucleótidos presentes en una muestra. todas son correctas.

Las ventajas de las técnicas de PCR y sus variantes sobre otras técnicas utilizadas en biología molecular son: Considerable ahorro de tiempo (La PCR tiene lugar en minutos, mientras que la clonación tiene lugar en días). La PCR es un proceso manual. La PCR requiere una cantidad de muestra mucho menor. La PCR permite la desnaturalización de secuencias concretas.

Aplicaciones de la PCR. diagnóstico y pronóstico de enfermedades. evolución y respuesta a tratamientos. mutagénesis. medicina forense.

Técnica que consiste en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro, de manera que a partir de una única molécula de ADN molde se obtienen múltiples copias.

¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica de PCR únicamente se replique el fragmento que nos interesa?.

¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde?.

oligonucleótidos monocaternarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.

los cebadores son. secuencias de oligonucleótidos monocatenarios. secuencias de ácidos nucleicos monocatenarios. secuencias de nucleótidos monocatenarios. secuencias de oligonucleicos monocatenarios.

Señala la correcta. el cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´--> 5´se denomina cebador R. el cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´--> 5´se denomina cebador forward. el cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´--> 3´se denomina cebador F. el cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´--> 3´se denomina cebador reverse. B y D son correctas.

El sustrato ideal para la actividad enzimática de la ADN polimerasa es. una molécula bicatenaria de ADN con regiones de monocatenarias a las que unirse. una molécula monocatenaria de ARN. una molécula monocatenaria de ADN con una región en doble hélice a la que unirse. una molécula monocatenaria de ADN a la que unirse.

señala la correcta respecto a la ADN polimerasas. se unen a la cadena de ADN y empieza a incorporar nucleótidos a la hebra molde. se unen a la cadena de ADN y empieza a incorporar bases nitrogenadas a la hebra molde. se unen a la cadena de ADN y empieza a incorporar ácidos nucleicos a la hebra molde. se unen a la cadena de ADN y empieza a incorporar bases complementarias a la hebra molde.

En la PCR la región en doble hélice la proporcionan:

En cuanto a la longitud de los cebadores. debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos. debe estar comprendida entre 35 y 65 nucleótidos. debe estar comprendida entre 52 y 65 nucleótidos. debe estar comprendida entre 40 y 60 nucleótidos.

Los mejores resultados en la PCR se obtienen con cebadores que tienen: un contenido en G+C comprendido entre el 40 y 60%. un contenido en G+C comprendido entre el 18 y 30%. un contenido en A+C comprendido entre el 40 y 60%. un contenido en G+C comprendido entre el 40 y 80%.

La Tm de los cebadores debería estar en el rango de temperatura de : 52-65ºC. 50-65ºC. 55-62ºC. 55-60ºC.

Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar nuevas cadenas de ADN es necesario que el ADN molde sea.

Enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas, con actividad polimerasa a temperaturas elevadas.

Señala la incorrecta respecto a las ADN polimerasas. realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 90 y 95ºC. tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95ºC. Algunas tienen actividad exonucleasa 5´-->3´y 3´--> 5´. algunas tienen actividad transcriptas inversa.

Fases del ciclo básico de una PCR.

El resultado final de cada ciclo de la PCR es.

Señala la/las correctas. la fase de desnaturalización se realiza a 94-95º. la fase de desnaturalización se realiza durante 2 minutos. la hibridación se realiza a una temperatura de entre 50 y 60º. el valor de la Tm de los cebadores suele estar comprendido en el rango Tm +- 5º.

El tiempo de la fase de extensión está condicionado por.

forma más simple de PCR en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación.

la mezcla de reacción debe contener.

una concentración baja de iones Mg provoca.

una concentración elevada de iones Mg provoca.

marca la incorrecta. la mezcla debe contener los 4 nucleótidos que componen el ADN. La ADN polimerasa siempre requiere la misma cantidad de iones Mg. la concentración final de cada cebador en la mezcla debe ser la misma. la complejidad del ADN que se estudia depende de su cantidad en la mezcla. B y D son incorrectas.

volumen frecuente de mezcla. 40-60 μl. 25-50μl. 18-30μl. 52-65μl.

Evita la aparición de productos truncados. PCR estándar. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR de grandes fragmentos.

se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes. PCR estándar. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad.

dos reacciones de PCR acopladas donde los ampliaciones de la 1ª serán los ADN moldes de la 2ª. PCR múltiple. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR anidada. PCR con transcripción inversa.

Amplifica ARN. PCR múltiple. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR anidada. PCR con transcripción inversa.

necesita un paso previo de síntesis de ADNc mediante una enzima. PCR múltiple. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR anidada. PCR con transcripción inversa.

en ella participan cebadores externos e internos. PCR múltiple. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR anidada. PCR con transcripción inversa.

evita la aparición de productos de amplificación no deseados eliminando la actividad de la enzima a bajas temperaturas. PCR múltiple. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR anidada. PCR con transcripción inversa.

se usa en expresión génica y clonación. PCR múltiple. PCR a tiempo real. PCR con inicio en caliente. PCR de alta fidelidad. PCR anidada. PCR con transcripción inversa.

señala la correcta respecto a la PCR a tiempo real. la curva de desnaturalización es de tipo sigmoide. permite cuantificar la cantidad final de una molécula de ácido nucleico en una muestra. la curva de fusión es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la velocidad de la reacción. una disminución importante de la Tm del híbrido sonda-secuencia diana cuando hay una base desapareada indica mutación puntual.

señala la correcta respecto a las aplicaciones de la PCR a tiempo real. cuanto mayor es el número de secuencias diana, menos ciclos son necesarios para alcanzar el CP. cuanto menor es el número de secuencias diana, menos ciclos son necesarios para alcanzar el CP. cuanto mayor es el número de secuencias diana, más ciclos son necesarios para alcanzar el CP. cuanto mayor es el número de secuencias diana, menos PCRs son necesarios para alcanzar el CP. cuanto menor es el número de secuencias diana, menos PCRs son necesarios para alcanzar el CP.

señala la incorrecta respecto a la curva de fusión. forma parte de la PCR a tiempo real. observamos un punto de inflexión o subida brusca de la fluorescencia cuando se alcanza el punto de fusión del amplicón. se hace una derivada de esta curva de fusión para obtener la curva de picos de fusión. la curva de fusión es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la temperatura.

no forma parte de los sistemas de detección específicos de secuencia. sondas de hidrólisis. balizas moleculares. sondas FRET. cebadores internos.

el punto de corte es. ciclo en el que se alcanza un valor por encima del límite de detección. lo mismo que el ciclo umbral. ciclo de la curva de fusión en que se pasa de la zona de ruido a la de crecimiento exponencial. todas son correctas.

señala la correcta. los sistemas de detección independientes de secuencias emplean sondas oligonucleótidas con fluorocromos. los sistemas de detección independientes de secuencias emplean agentes fluorescentes intercalantes. los sistemas de detección dependientes de secuencias emplean sondas oligonucleótidas con fluorocromos. los sistemas de detección dependientes de secuencias emplean agentes fluorescentes intercalantes.

señala la correcta. los sistemas de detección específicos de secuencias emplean sondas oligonucleótidas con fluorocromos. los sistemas de detección inespecíficos de secuencias emplean agentes fluorescentes intercalantes. los sistemas de detección específicos de secuencias emplean sondas oligonucleótidas con fluorocromos. los sistemas de detección inespecíficos de secuencias emplean agentes fluorescentes intercalantes.

señala la incorrecta respecto a la PCR de grandes fragmentos. evita la aparición de productos truncados. emplea aditivos que estabilizan la enzima como la glicerina. aumenta el rendimiento al amplificar fragmentos entre 5 y 35Kb. Baja concentración de potasio en el tampón de reacción.

señala la correcta respecto a la curva de fusión. se obtiene representando la fluorescencia frente a la concentración de secuencia diana. se emplea en la detección de mutaciones. un aumento importante de la Tm del híbrido secuencia-sonda cuando hay una base desapareada indica mutación puntual. un único pico o punto de inflexión indica que la PCR ha sido específica.

no se relaciona con la PCR con inicio caliente. usar ADN polimerasa correctora. mezcla de la reacción sin ADN polimerasa. ADN polimerasa aislada en la mezcla de reacción en esferas de cera. ADN polimerasa inactivada.

marca las correctas respecto a la PCR de grandes fragmentos. uso de ADN polimerasa mayoritaria correctora. uso de ADN polimerasa mayoritaria no correctora. aditivos que estabilizan la enzima como el glicerol. usar ADN polimerasa correctora. baja concentración de potasio en el tampón de reacción. favorecer las condiciones de la enzima mediante el pH y la concentración de Mg2+.

señala la/las correctas sobre los cebadores. longitud entre 18-30 nucleótidos. bases 40-60% A+T. Tm: 52-65º. definen y determinar la región diana. proporcionan la región monocatenaria para la ADN polimerasa. Forward se une en dirección 3´-5´.

señala la correcta respecto a la temperatura óptima de las ADN polimerasa. 52-65º. 70-75º. 94-94º. 50-60º.

señala la correcta respecto a la temperatura de desnaturalización del ADN molde. 52-65º. 70-75º. 94-94º. 50-60º.

señala la correcta respecto a la temperatura de hibridación. 52-65º. 70-75º. 94-94º. 50-65º.

señala la correcta respecto a la duración de la fase de desnaturalización. 15-30s. condicionado por la velocidad de polimerización y la longitud del fragmento diana. horas. 30-60s.

señala la correcta respecto a la duración de la fase de extensión. 15-30s. condicionado por la velocidad de polimerización y la longitud del fragmento diana. horas. 30-60s.

señala la correcta respecto a la duración de la fase de hibridación. 15-30s. condicionado por la velocidad de polimerización y la longitud del fragmento diana. horas. 30-60s.